主页 > 新闻动态 > 行业新闻 >

(便携式蠕动泵)柱层析介绍

时间:2021-07-01 09:35 点击:
在过去的三十年中,分离生物大分子的各种技术和方法得到了不断的发展。随着各种介质的完善和商品化,使以填料为核心的柱层析技术在天然产物等粗提后的纯化中起到了重要作用。 
1 疏水作用柱层析(Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC) 
HIC是以蛋白质的疏水性为分离基础的。具体说就是一种通过表面疏水性差异来分离蛋白质的柱层析方法。 
疏水键的形成对于非极性基双方无特异性要求,不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同,这也是HIC分离蛋白质的根本所在。在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸,其强弱顺序为Trp、Ile、Phe、Pro、ValLeu、Met、Ala。当介质和上样蛋白浓度不变时,影响HIC的因素较多,主要有①盐类,其作用是使暴露出界面的非极性基,使容易形成疏水作用,其次是增加水相极性,提高界面的表面张力,盐浓度越高,促疏水作用越强。一般常采用的促疏盐为(NH4)2SO4。②混溶有机溶剂,作用是使界面张力减弱,减少疏水作用。③温度,当体系温度由4℃升高到25℃时,疏水作用力增加20%~30%,这主要是由于动能增大,提高表面张力,一般当温度降低,可增大盐浓度,使疏水作用不降低。④pH,当pH≈pI时可消除表面电荷的相斥作用,同时表面活性剂与变性剂也对其有影响。 
HIC适用范围广,原则上可用于所有蛋白质纯化,处理量大,特别是从大体积样品中提取低含量的目标蛋白显优势,可取代传统的盐析沉淀技术。HIC对DNA及小牛血清(其中的白蛋白、免疫球蛋白、氨基酸等成分)去除率较高,尤其是对细胞DNA一步去除率可达90%以上。原则上HIC可放在纯化工艺的任何位置,但大部分放在前面。由于它也属吸附型柱层析,尤其是对蛋白质空间内部的疏水作用可使此步损失较大,对蛋白质的结构也有微细作用。 2凝胶过滤柱层析(Gel Filtration Chromatography,GFC) 
GFC是以分子大小和形状为分离基础的。具体说就是利用不同大小分子通过凝胶滞留时间的差别来分离混合物的柱层析方法。另外一种说法是分离是以分子体积的大小为基础的,分子体积即分子溶剂化后的体积,受分子形状和相对分子质量两方面因素的影响。有时加入变性剂(尿素、盐酸胍等)以破坏蛋白质的三、四级结构,可以使分离主要受控于相对分子质量的大小。 
GFC特别适用于分离相对分子质量大于2000的高分子化合物和相对分子质量差异大的混合物及低聚物。GFC的分离不依赖于流动相和固定相的相互作用,所以不必使用梯度洗脱。但是由于电荷屏蔽的因素,为了降低填料与生物分子之间的相互作用,往往会适当提高盐浓度,**少高于0.05 mol/LNaCl。由于试样在柱中的保留时间不会超出柱中溶剂的总体积(Vt),所以不会出现在其他液相色谱中经常出现的由于色谱峰的弥散而引起的检测极限GFC的容量通常由流动相效应来控制。由于GFC的分离靠大小组分流程途径长短之差达到分离,柱要有足够的长度(75~100 cm),但由于微小的粒子在GFC也有扩散的效应,柱子又不可过长,上样量不可过多(<20%Vt)。因为GFC洗脱时间可粗略估计,所以再隔一定时间连续进样,提高柱的使用效率,缩短纯化周期。除了以上特点外,GFC还有回收率较高,洗脱条件温和,不易发生副反应,使用寿命较长,同时可用作换盐等特点。但由于处理量小,分离蛋白能力相对较弱,柱层析时间较长,在设计纯化工艺时一般不宜放在前面。 
3离子交换柱层析(Ion Exchange Chromatography,IEC) 
IEC是以蛋白质分子净电荷和表面电荷分布为分离基础的。具体说就是利用蛋白质带电性的差异,在离子吸附剂上静电吸附能力不同,用不同的pH/离子强度洗脱液洗脱,从而使蛋白质分离的柱层析方法。离子交换又分为阴离子交换和阳离子交换。离子交换剂又有强弱之分,强的离子交换剂在整个pH范围内都是离子化的,而弱的离子交换剂通常仅在pH6~9之间是离子化状态,因而后者对所适用的pH范围又有了进一步的限制。 
在洗脱方式上,阳离子交换主要是改变pH,它主要应用于等电点大于5的蛋白质;而阴离子交换主要是改变盐浓度,适用于大部分蛋白质。20种氨基酸中,大部分带正电或负电,这是IEC应用范围广的原因。IEC处理量大,附载系数高,一步缩小样品体积很多。IEC去除杂质能力强,如对热原质,核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白,及电荷性有差别的蛋白均可去除。它还有一个特点,利用蛋白质在不同pH和盐浓度下带电性的不同,通过不同条件下应用同种类型或不同类型介质(如DEAE、CM),分两步IEC使目标蛋白质达到提纯目的,这是除亲和柱层析外,别的柱层析达不到的分离能力。IEC原则上讲可放在纯化工艺的任何一步,它属吸附型层析,单步损失也较大。扩大纯化工艺时,尤其要按放大直径考虑,而不能只单独放大柱高。一般来说柱高不能大于柱直径的4倍,否则纯化结果和小试会相差较多。 
IEC的洗脱一般分3种:①同步洗脱(Isocratic),即盐浓度不变,这一般都应用于样品的性质已熟知,洗脱重复性好,而且大部分是用于分析类分离。②分步洗脱(Stepwise),即用几次同步洗脱方式,分别换几次盐浓度分步洗脱。这种方式大部分用于在其中一种盐浓度洗脱峰中收获一种目标蛋白,但这种方式也存在一些问题,如一个洗脱峰可含有二种蛋白或一个蛋白分散于两个峰中,所以一般分步洗脱方式**好用于已知性质的蛋白质分离。③梯度洗脱(Gradient),按一定的浓度梯度连续改变盐浓度进行洗脱的方式。如增加速度不变称为线性梯度洗脱(Line Gradient),这种方式在三种洗脱中响应能力**强,蛋白峰形一般不会拖尾,很少有一种蛋白出现在几个峰中。所以对电荷性质相近组分的分离和蛋白质较大、表面电荷分布范围广的组分的分离**好采用这种方式。 4亲和柱层析(Affinity Chromatography,AC) 

相关新闻

*如果您遇到任何创锐蠕动泵产品操作或者质量问题,请及时与我们联系。

*保定市创锐泵业有限公司保证7 * 24小时在线。

*创锐蠕动泵品牌产品具有一年保修和终身维护。

*本网站的产品图片,型号,数据,功能,性能,电机型号,规格及其他参数仅供参考。 创锐蠕动泵可以改善上述内容。 有关详细信息,请参阅产品手册。 除非另有说明,否则本网站包含的数据均为创锐蠕动泵内部测试结果。